この論文が私のベスト作です。論文紹介
笠松正憲、辻卓夫 (名古屋市立大学皮膚科学教室)
三浦真理子 (ＳＲＬ（株）研究部)
この論文が私のベスト作です。
掲載雑誌：アレルギー Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ７，１９９３，８７８～８８１
速報覧
コメント： 名古屋市立大学皮膚科でアトピー性皮膚炎の専門外来をしていた際、当時脚光をあびていたサイトカインの測定は細胞培養操作を必要とする時間も手間のかかる検査でした。これを手軽に血清で測れないか？大量に測定できないか？を工夫したのがこの論文です。ＩｇＥと比べると重症度とよく相関し、優れた方法だと感じました。当時は斬新な方法で、日本アレルギー学会学会誌” アレルギー”にもこのように速報版として掲載していただけました。ＩｇＥにとってかわる検査法だ！と当時はがんばったのですが・・・・・。
Interleukin-4(ILｰ4)の高感度定量法として，化学発光基質<3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane>(AMPPD)を用いたsandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)法を行った。材料は血清。測定感度は0.17pg/dlと非常に高いものであった。アトピー性皮膚炎患者血清のみならず，正常人コントロール血清においても実測値を得られた。さらに，その値に有意な差（p<0.05）を認めた。
緒言
Ⅰ型アレルギー反応は気管支喘息，アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患においてその病態を形成する上で重要である。この反応は，免疫担当細胞によるIgE抗体産生，IgE抗体のFcεRⅠを介した肥満細胞・好塩基球への結合，アレルゲンとIgE抗体とによる抗原抗体反応，さらにはIgE抗体の架橋による化学伝達物質の遊離が生じ毛細血管透過性亢進，平滑筋収縮などが惹起されるものである。また，この反応には好酸球，好中球，血小板，マクロファージなどの関与も知られている。ところで，Ⅰ型反応の進行には免疫担当細胞の存在の他，サイトカインの存在が不可欠である。近年の分子生物学の進歩により，サイトカインやそのレセプターの遺伝子も次々にクローニングされ，リコンビナント分子を用いて機能の解析が進められている。ILｰ4が，IgE産生，FcεRの発現，肥満細胞の増殖などに関与していることはよく知られており，その定量には大きな意味がある。今回我々は，AMPPDを基質とした化学発光sandwich ELISA法で血清ILｰ4の測定を行った。
対象
名古屋市立大学医学部付属病院皮膚科を受診したアトピー性皮膚炎患者49人を対象とした。性別：男29人，女20人。年齢：平均26.8才（7～74才）。なお，事前に患者に対しては，本試験の趣意を十分に説明した上で同意を得た。コントロールは正常人ボランティア69人を対象とした。性別：男32人，女37人。年齢：平均30.5才（21～50才）。
材料および方法
（１）材料
採血は分離剤入り汎用採血管を用い，約30分後に血清を常温で遠心分離し，ー80゜Ｃで保存した。
（２）方法
ILｰ4の測定法はAMPPD１）を基質とした化学発光ELISA２）を用いた（Fig.1）。①固相である96穴マイクロプレート（発光用）に固相用緩衝液で希釈した抗ヒトIL-4モノクローナル抗体（Genzyme社製）＜濃度5μg/ml＞を100μl/wellづつ分注し，4゜Ｃで一晩放置し抗IL-4抗体を固相化した。
②高純度BSA（ウシ血清アルブミン）の2％溶液を200μl/well分注し，室温（約25゜Ｃ）で2時間，固層のブロッキングを行った。
③洗浄緩衝液（0.05％Tween20含有PBS(-)）で3回洗浄した後，抗原を加え，一次反応を行った。抗原として検量線作成のための標準サンプル（スタンダード）であるリコンビナントIL-4（Ｒ＆Ｄ社製）を希釈緩衝液（1％精製BSA、0.05％Tween20含有PBS(-)）で段階希釈したものと，被検血清サンプルを希釈したものを100μl/well分注した。分注後，室温で一晩反応させた。
④洗浄緩衝液で3回洗浄した後，二次抗体であるウサギ抗ヒトIL-4ポリクローナル抗体（コスモ社製）＜濃度3μg/ml＞を分注し，室温で3時間反応させた（二次反応）。
⑤アルカリフォスファターゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）を100μl/well分注し，室温で１時間反応させた（三次反応）。
⑥洗浄緩衝液で４回洗浄した後，増感剤（コスモ社製：ＢＭＥＲＡＬＤＴＭ）を共存させたAMPPD溶液を加えて，酵素反応を行った。
⑦発光強度はマイクロルミノメーター（ダイナテック社）を用いて測定した。
（３）データの解析
検定は，対応のないWilcoxon検定を用いた。p＜0.05を有意な差とした。
結果
血清IL-4値はアトピー性皮膚炎患者群では1.50±1.36pg/dl，コントロール群では0.788±0.624pg/dlであった。（データは省略。詳細をお知りになりたい方は論文を御覧ください。）両群の血清IL-4値を対応のないWilcoxon検定を用いて比較したところ両群間に有意な差（p＜0.05）が認められた。
考察
IL-4は，主としてヘルパーＴ細胞より産生され，Ｔ細胞・Ｂ細胞および他の血球細胞に広範な生理活性を有するサイトカインである３）。当初”Ｂcell stimulatory factorーＩ”の名で報告されていたように，Ｂ細胞に対する作用については多くの研究成果がある４ー９）。最近では，Ｔ細胞および他の細胞に対する広範な活性が次々に明らかになってきている１０，１１，１２）。IL-4は活性化Ｂ細胞においてIgE、IgG1を濃度依存性に強く誘導するなど免疫グロブリンのクラススイッチに大きく関与している１３、１４、１５）。また、FcεRの発現を誘導し１６）、IL-3と共同で肥満細胞の増殖を促進する１７）などⅠ型アレルギー反応の成立過程に深く関わっているサイトカインである。アトピー性皮膚炎患者と健常人ではIL-4に対する反応性に差があることがわかった。Furueら１８）はアトピー性皮膚炎患者および健常人の末梢血単核球にIL-4を加え増殖能（応答性）を調べ，アトピー性皮膚炎患者の末梢血単核球の応答性は健常人のそれに比べ有意に亢進していることを明かにした。また最近，表皮の抗原提示細胞であるランゲルハンス細胞上に，高親和性FcεR（FcεRⅠ）が存在することが明らかとなり１９，２０），今後さらにIL-4とアトピー性皮膚炎の関係が問題となろう。
従来のヒトIL-4 ELISAテストキット（Genzyme社製，Inter Testｰ4ＴＭ）などによる測定では，IL-4高値が予想されるアレルギー性疾患患者の血清あるいは血漿でさえ，期待される値を検出し得なかった。また，細胞培養操作を経た細胞培養上清を材料とする方法では，培養条件などにより誤差が生じ易い欠点があった。そこで今回，我々は血清を材料として，Fig.1に示すようにAMPPDを基質とした化学発光ELISA法で血清ILｰ4の測定を行った。アトピー性皮膚炎患者及びコントロールにおいて実測値を得られ，さらにコントロールに比しアトピー性皮膚炎患者において，有意（p＜0.05）な高値を認めた。これまでに血清中のILｰ4が実測できたとの報告は稀で，我々が調べた限りでは，内臓リーシュマニア症患者に検出したもの２１），骨髄移植後患者および正常人の一部に検出したもの２２）のみである。我々の方法は，収集保存が比較的簡単な血清を材料としたこと，正常人においても実測可能であることに大きな意義がある。今後，Ⅰ型アレルギー反応の発現に深く関わっていると推定される気管支喘息を含めた各種疾患の病態解明や治療法の開発に臨床応用が期待される。
（Fig.1）sandwich ELISA for IL4
96 well microplate
↓
anti IL-4 Monoclonal Ab（5μg/ml）
↓ Standing at 4℃ for 16hrs、Washing with PBS-Tween
2％BAS in Carbonate buffer
↓ Incubation at RT for 2hrs、 Washing with PBS-Tween
Standard or Sample（1/5～1/11 dll）
↓ Incubation at RT for 16hrs、 Washing with PBS-Tween
anti IL-4 Polyclonal Ab（3μg/ml） （Affinity purified）
↓ Incubation at RT for 3hrs、 Washing with PBS-Tween
anti Rabbit IgG-AP（2500 dll）
↓ Incubation at RT for 1hr、 Washing with PBS-Tween
AMPPD（with enhancer）
↓
Measureed the Luminescence
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